本研究将从浓香型白酒厂提供的酒醅中分离酵母菌，对其生理生化特性和发酵特性进行鉴定，以期获得可以工业应用的酵母菌种。本试验将酒醅菌液接种至YPD液体培养基中进行增菌培养，然后将增菌培养液接种至含有氯霉素的麦芽汁琼脂培养基。经菌落特征、细胞形态、生理生化特征等方法，筛选出三株酵母菌。对三株酵母菌在30℃条件下进行发酵实验，测酵母菌产酒精能力，并通过色谱分析测发酵液中产酯情况。
关键词：白酒;酒醅;酵母菌
王友利
(江苏御珍酒业有限公司)
白酒是我国特有的传统蒸馏酒，在漫长的发展过程中形成了独特的工艺和风味特征。酵母菌在原料淀粉质的糖化，酒精的生成，香气物质的形成等方面都起着重要的作用，因此探讨酵母微生物区系的变化，甚至特定发酵阶段的种群结构对白酒生产都有重要的指导意义。
为了比较准确地把握发酵过程中酒醅微生物区系的演变规律，为浓香型白酒的窖池发酵机理及物质代谢过程的深入探讨奠定良好的研究基础，以便弄清发酵过程中物质变化趋势与产品质量及成分组成之间的相关关系，更好地指导浓香型白酒的发酵生产，江南大学对酱香型白酒发酵窖池内酵母菌系的结构与功能进行了研究。本课题对浓香型窖池酒醅中微生物的分离培养、酒醅微生物的主要类群分析等方面进行了一些探索，以期为浓香型酿造机理奠定基础。
酵母菌一般自然分布于高糖偏酸环境，适宜的生长温度为25～30℃。酵母菌是兼性厌氧微生物，白酒发酵的主酵菌群在传统白酒发酵过程中，当通气充分时，酵母菌进行好氧呼吸，代谢能力强、速度快，菌体生长繁殖旺盛，在厌氧发酵阶段的厌气条件下，进行厌氧呼吸，经厌氧乙醇发酵代谢途径，发酵产生乙醇及相关发酵产物在白酒发酵过程中，酵母菌一般在厌氧发酵的前期，产生乙醇的能力较强，但随着发酵过程的进行，酵母菌与环境生态因子之间的相互作用，酸性物质也逐渐产生和积累，通常导致发酵环境的pH下降，进而使酵母菌生理代谢逐渐受到抑制，对发酵原料的转化利用能力及乙醇的发酵生产能力也逐渐下降，甚至停止。
酒醅中酵母菌类以酵母菌属为主，其次是有一定产香和产酒精能力的汉逊酵母和假丝酵母。酵母菌属、汉逊酵母都属原子囊菌亚纲、酵母目，假丝酵母是属半知菌类的稳球酵母科各属。筛选出酵母菌对酵母菌进行分析，从而得出白酒中酵母菌的种类，从而更加了解酵母菌在发酵过程中的作用。
1、材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株
酵母菌采样于江苏御珍酒业有限公司某车间小组的酒醅。
1.1.2 培养基
富集培养基：
YPD培养基：10g酵母浸膏，20g蛋白胨，20g葡萄糖，1000mL蒸馏水，121℃，灭菌20min;
酵母菌分离培养基：
麦芽汁琼脂培养基：麦芽膏粉130g，琼脂15g，氯霉素0.1g，1000mL蒸馏水，121℃，灭菌20min;
碳源基础培养基：
硫酸铵2g，硫酸镁0.2g，磷酸二氢钠0.5g，氯化钙0.1g，磷酸氢二钾0.5g，1000mL蒸馏水;
氮源基础培养基：
磷酸二氢钾1.36g，氯化钙0.005g，磷酸氢二钠2.13g，葡萄糖10g，硫酸镁0.2g，硫酸铁0.0005g，1000mL蒸馏水。
1.1.3 主要仪器
见表1。
1.2 方法
1.2.1 酵母菌的分离
将白酒大叉10g放入50mL无菌水中，振荡、摇匀，制备菌悬液，将菌悬液进行稀释，按10%的接种量接种至YPD富集培养基中，在摇床中30℃，90rpm，进行12～24h的富集培养，镜检培养基中是否有酵母，将富集培养后的酵母进行梯度稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，吸取梯度为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的稀释液200μL菌悬液涂布到含有氯霉素的麦芽汁琼脂平板上，在恒温培养箱中30℃，培养48～72h，对酵母菌进行分离。
1.2.2 酵母菌的纯化
对分离麦芽汁琼脂平板上的菌种进行镜检，挑去具有酵母菌特征外形的菌落进行检测，检测是否为酵母。镜检后，挑取经镜检为酵母菌的平板的单菌落，进行划线到麦芽汁琼脂平板，在恒温培养箱中30℃培养24h结合镜检，不断进行划线分离纯化出单一酵母菌株。
1.2.3形态与培养特征
将酵母菌接种到YPD液体培养基中，在恒温培养箱中30℃，90rpm恒温培养1-2d，观察是否发酵、培养液是否浑浊，是否形成环或岛，是否有沉淀及沉淀松紧情况，并制成水镜片于显微镜下观察，记录酵母的无性繁殖与细胞的形状，将酵母菌接种在麦芽汁琼脂培养基上，在30℃培养3～4d，观察其菌落形态。
1.2.4酵母菌理化指标测定
(1)碳源同化实验
鉴定同化碳源种类有葡萄糖、麦芽糖、α-乳糖、蔗糖、棉籽糖、半乳糖、淀粉纤维二糖。
将上述一定量的碳源，分别加入到氮源基础培养基中，灭菌115℃，20min。将经活化后的酵母菌分别接种至上述含有不同碳源的培养基中，30℃条件下恒温培养，观察其是否生长，且生长良好。结果观察标准：将已培养数天的试管于混合振荡器上摇动，使内容物充分混匀。在一张白色卡片上画一条约3/4mm 宽的线，将卡片紧靠试管，直对自然光观察，如果能看到不连续线段的清晰边缘，则记为+;如果溶液非常澄清，记为-，表示未有酵母生长，实验设置三次重复，以不加碳源的培养基作为对照。
(2)氮源同化实验
鉴定同化氮源种类为硝酸钾、硫酸铵。
该实验主要观察分别以硝酸钾、硫酸铵为唯一氮源时，酵母菌的生长情况。将氮源按照添加比例0.078%(w/w)加入到碳源基础培养基中，灭菌115℃，20min，将活化后的酵母分别接种至含有不同氮源的培养基中，30℃条件下恒温培养一周，结果观察标准：将已培养数天的试管于混合振荡器上摇动，使内容物充分混匀。在一张白色卡片上画一条约3/4mm 宽的线，将卡片紧靠试管，直对自然光观察，如果能看到不连续线段的清晰边缘，则记为+;如果溶液非常澄清，记为-，表示未有酵母生长，以不加氮源的培养基作为对照，实验设置三次重复。
1.2.5酵母菌发酵
(1)酵母菌发酵
按照发酵培养基体积的 10%的接种量，接种到发酵培养基中。具体操作如下：
①菌种在YPD斜面上30℃活化两次，接种于装有100mL的12°Brix麦芽汁的250mL的锥形瓶中，30℃培养12～18小时;
②发酵使用500mL三角瓶，内装300mL发酵培养基，当细胞数目达到对数生长期时，将二级种子液接种30mL入发酵培养基中，8层纱布封口，30℃静置培养，静置发酵5d;
③发酵完成后测定残醪的酒精度。并对发酵液进行处理，供后期数据的处理与分析。
(2)酒精含量测定
将待测样品中酒精用蒸馏法馏出，采用重铬酸钾-分光光度法于600nm波长处测定。精蒸馏采用干燥100mL容量瓶，准确量取发酵液100mL于500ml蒸馏瓶，用50mL蒸馏水分三次冲洗容量瓶.洗液并入蒸馏瓶。连接蛇形冷却管，用前述取样用100mL容量瓶做接收器(外加冰浴)，开启冷却水缓慢加热蒸馏，控制蒸馏速度，使蒸馏在30～40min内完成。收集馏出液，当接近100ml刻度时，取下容量瓶，盖塞，于20℃水浴中保温30min，再补加水至刻度，混匀备用。
(3)色谱分析
发酵液蒸馏：用干燥100mL容量瓶，准确量取发酵液100mL于500ml蒸馏瓶，用50mL蒸馏水分三次冲洗容量瓶.洗液并入蒸馏瓶。连接蛇形冷却管，用前述取样用100mL容量瓶做接收器(外加冰浴)，开启冷却水缓慢加热蒸馏，控制蒸馏速度，使蒸馏在30～40min内完成。收集馏出液，将馏出液进行色谱分析。
色谱柱为CP-WAX57CP，毛细血管柱(长度50m，内径0.25mm，膜厚0.2μm)，柱温采用程序升温，初始温度35℃，保持8min后以4℃/min升至75℃，保持2min，继续以15℃/min升温至180℃，保持2min，再以10℃/min升至210℃，保持13min，以进样量1μL/min分流进样，分流比50:1。载气为氮气，进气量25mL/min，检测器温度300℃。
2、结果与讨论
白酒的生产以泥窖窖池为基础，窖池中的多种微生物，特别是栖息于酒醅中的微生物左右着酒的产量和品质。酵母菌在原料淀粉质的糖化和酒精的生成，香气物质的形成等方面都起着重要的作用，是窖池发酵三大菌群之一。
在培养基中添加抗生素等抑菌物质，可以干扰细菌细胞壁的生物合成，减少菌液中细菌含量，从而提高酵母菌分离选育效率。
本实验采用YPD富集培养基对酵母菌进行富集培养12-24小时，于此时吸取菌液涂布于含有氯霉素的麦芽汁琼脂培养基，抑制细菌生长，提高酵母分离效率，选取三株单菌落进行划线，结合镜检纯化出单菌落酵母菌，斜面低温保存。
2.1 酵母菌的分析
2.1.1形态与培养特征
(1)平板培养特征：见图1。
上图为酵母菌接种在麦芽汁琼脂培养基上，在30℃培养2d后酵母菌的平板菌落形态，由上图知其中A1酵母菌，直径1～4mm，圆形，乳白色，奶油状，不透明，表面光滑，粘稠，有发酵香气;A2酵母菌，圆形，直径1～4mm，圆形，乳白色，奶油状，不透明，表面光滑，粘稠，有发酵香气;A3酵母菌，圆形，直径1～3mm，圆形，乳白色，菌落表面干燥有褶皱，边缘不整齐，中间凸起，无发酵香气。
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