稳定同位素比质谱技术在酒行业的应用

经过多年规范发展，白酒行业逐步由手工作坊式生产向生产自动智能化转型。然而，在正向发展的背景下，行业仍存在较多问题，比如添加剂超范围使用、液态法（或固液法）白酒冒充自然纯粮酿造、
           伪冒仿造名优白酒等问题。此外，还有年份酒标准的缺失增加市场混乱，如何进行“地理标志产品”的保护等，这些都是亟待解决的问题。稳定同位素比质谱技术为解决这些问题提供了可能。
           本文从稳定同位素比质谱技术介绍、国外现有应用以及我国葡萄酒标准立项这几方面出发，提出该技术在白酒行业应用的潜力，以期推动我国白酒行业质控水平的提升。
关键词：白酒行业；质量控制；稳定同位素比质谱；应用

源坤鉴酒技术团队
（四川省食品品检验检测院）

1 引言
    　白酒是我国传统的优势食品行业之一，凭借着独特的地理环境和代代传承的酿造工艺以及从业者不断对白酒行业开展的创新工作，使得既具有物质属性，又有精神内涵的传统白酒逐步由手工作坊式的生产向生产自动智能化转型。
　　在这些进步的光鲜下，我们不能忽视行业仍然存在严重并亟待解决的问题：
　　以固液法白酒或液态法白酒冒充固态法白酒为首的虚假标识带来的诚信危机；
　　配制酒产品质量的管理和食品安全的监管盲点是重要的风险来源；
　　白酒酿造所用原辅材料和其他相关物品带来的潜在风险值得关注；
　　白酒标准制定的滞后以及白酒标准的混乱助长了白酒行业的食品安全风险，等等。
　　细分这些问题，不难发现，白酒真实性的判定是行业人士和消费者普遍关注的问题，也是一直困扰行业的问题，我们也一直在思考和探索如何用技术和管理的手段去规范企业的生产行为。
    　添加剂超范围使用、食用酒精勾兑冒充自然纯粮酿造、伪冒仿造名优等都属于白酒真实性判定的一部分，这些危害白酒真实性的行为给行业带来恶劣的社会影响，损害了酒企尤其是名优酒企的声誉。
　　本文介绍了国内外稳定同位素比质谱技术在酒行业的应用，以期为我国白酒行业质控和真实性检测提供参考。
2 稳定同位素比质谱技术原理
    　稳定同位素文章来源华夏酒报在自然界存在分馏现象。比如海水的蒸发过程中氧同位素发生分馏，海水富集18O，云层随着降雨过程而富集16O，雨水降落在极地冰盖上使得极地冰盖富集16O。此外，绿色植物的光合作用对同位素也起到分馏作用，常用稳定同位素分馏原因见表1所示。分馏现象使不同区域或者不同物体的同位素比值存在差异，这是IRMS的客观基础。

    　同位素比质谱仪先将样品转化成气体（如CO2，N2，SO2或H2），在离子源中将气体分子离子化，接着将离子化气体打入飞行管中。飞行管是弯曲的，磁铁置于其上方，带电离子依据质量不同而分离，含有重同位素的分子弯曲程度小于含轻同位素的分子。
    　国外稳定同位素质谱技术用于食品领域的研究始于上世纪七十年代中后期，多年前已能利用该技术判断蜂蜜和果汁中是否掺假，并对肉制品的地理产地、有机和无机饲养进行了研究，国外已有利用稳定同位素质谱技术检测蜂蜜、酒类产品的相关标准。
　　在我国，稳定同位素质谱技术在地球科学及国家重大攻关和科研项目中发挥重要作用，在农业和食品检测及质量控制领域的应用刚刚起步。国家质量监督检验检疫总局依据美国公职分析化学师协会(AOAC)官方方法998.12《蜂蜜中C4植物糖含量-内标稳定碳同位素比率法》制定了同位素比质谱技术检测蜂蜜中碳-4植物糖含量的国家标准 《GB/T 18932.1-2002蜂蜜中碳-4植物糖含量测定方法 稳定碳同位素比率法》。然而，该技术用于我国酒类尤其是传统白酒的研究还处于萌芽状态。
3 国外酒类产品研究中的应用
    　在食品质量控制上，稳定同位素技术能利用自身优势解决常规分析技术无法解决的问题。因甜菜糖中δ13C约为-25.5‰，蔗糖中δ13C约为-11.5‰，应用碳同位素技术可识别C3植物甜菜和C4植物甘蔗产生的甜菜糖和蔗糖。同样的方法可以鉴别蜂蜜中掺入的蔗糖，或是区别天然香料（δ13C约为-20‰）和合成香料（δ13C＝-27‰）等。谷物发酵形成酒精的过程中碳同位素分馏不超过千分之几，所以也可用来鉴别酒类，例如酒类的产地、是否有添加香精香料等添加剂、是否以次充好。国外已利用稳定同位素比质谱技术对酒进行了深入研究，并制定了相应的检测标准。
3.1 国外学者研究动态
    　2001年，Nives Ogrinc用IRMS结合SNIF-NMR对Slovenia的产区的葡萄酒的真实性和产地进行研究。研究使用了102个葡萄酒样品，样品源于Slovenia三个不同的产区，年代为1996、1997和1998。稳定同位素数据用主成分分析(PCA)和线性判别分析（LDA）分析。研究发现乙醇分子的δ13C值和亚甲基部位的D/H比率能区分沿海和大陆产区的葡萄酒，同时用PCA和LDA处理δ18O值也可能使Drava和Sava这两个大陆产品的葡萄酒得到分离。研究还发现葡萄成熟和收获期间气候的变化会引起δ18O值的改变。只有将同位素技术用于实际生产，才能切实地利于葡萄酒掺假和掺水检测以及原产地鉴别。
    　2003年，Gérard Gremaud等利用稳定同位素比质谱数据结合微量元素和其他酒类的经典参数对瑞士葡萄酒进行区域鉴别。酒样是2000年和2001年份的，用IRMS测定了δD和δ18O值，ICP-MS测定了Mn、Al、B、Ba、Ca、Fe、Mg、Na、Rb、Sr、Zn含量，FT-IR测定了乙醇含量、pH值、总酸、挥发酸度、苹果酸、果糖、酒石酸、乳酸、琥珀酸、柠檬酸、甘油、2,3 -丁二醇、干物质、相对密度。结果显示，在考虑采用单变量来鉴别瑞士葡萄酒产地时，δ18O值、Sr、Rb以及乙醇含量所建立的模型有极好的识别度。
    　为保证样品有足够的代表性，Giovanni Calderone等选取了来自意大利、法国、德国等9个欧盟酒产区国家的1998年和1999年共计171个酒样，包括白酒和红酒，采用气相色谱-燃烧-同位素比质谱（GC-C-IRMS）测定白酒中甘油的δ13C值。甘油能改善酒的口感及和光滑度，因此有时添加到酒中提高酒的品质，这是被欧盟委员会法规禁止的。数据显示，对于真实的葡萄酒来讲，同一来源的甘油和乙醇的δ13C值有很好的线性相关性，R=0.90。甘油的δ13C值与乙醇的δ13C值之差的均值为－2.1‰。虽然这些参数不足以确定酒的原产地并鉴别是否掺假，但甘油和乙醇的δ13C值的相关性足以确定稳定同位素比质谱法是可用于鉴别酒类是否掺假的方法。
    　2008年，Ana I. Caba ero用HPLC-LRMS和GC-IRMS测定了葡萄酒乙醇的δ13C值，用于葡萄酒鉴别真伪。采用不同来源的23个酒样对测定δ13C值的两种方法进行验证，分析经典好于0.15‰，并且这两种处理方法没有明显的同位素分馏现象。两种方法测定的δ13C值没有显著差异，有很好的相关性。采用HPLC前处理具有快捷、简便的优势，这也是第一次在没有使用乙醇分离而直接对液体样品测定δ13C值。
    　2009年，Madeleine E. Spitzke等采用GC-C-IRMS测定了葡萄酒中乙醇和高级醇的δ13C值。50多个来自德国的葡萄酒样采用环己烷和2-甲基-2-丙醇混合萃取液萃取，再进行GC-C-IRMS分析。结果发现液-液萃取处理后乙醇的δ13C值和蒸馏处理后乙醇的δ13C值没有显著差异，R2为0.972，这说明样品制备中不会发生显著的同位素蒸馏效应。同时发现提取的高级醇中δ13C值与酒样中乙醇的δ13C值相关性好，R2为0.829。液-液萃取省时省力，需要样品量少，在分析高级醇中的表现使其有潜力应用于葡萄酒的防伪分析。
    　2010年，Costanza Aghemo等研究了意大利葡萄酒中同位素参数和葡萄生长环境的气候参数之间的相互关系。用SNIF-NMR和GC-C-IRMS分析了来自Nebbiolo和Barbera不同年份以及Piedmont不同产区的葡萄酒，获取了同位素（2H和13C）数据。利用同位素数据建立了起与平均温度、总降水量、平均湿度和有效积温的关系式。测定得到δ13C数据与平均温度和总降水量分别呈正比和反比的关系，而与其他的气候参数相关性低。此外，研究发现同一个葡萄园不同品种葡萄酿造的葡萄酒测得的同位素比值有明显差异。
    　Laurien Adami在2010年采用同位素比质谱技术区分了巴西不同的葡萄品种和葡萄酒的年份，并发现了葡萄、葡萄酒和地理位置之间的相互关系，通过该技术测定葡萄酒的产地以及地理和气候特点。用到的同位素比值有巴西葡萄酒中乙醇的δ13C以及酒水分中的δ18O值。实验证明，与乙醇中δ13C值相比，酒中水的δ18O值更适合用于判定葡萄酒的产区。
    　此外，还有很多用同位素比值来鉴别酒产品的真伪研究文献。Andreas Ro mann等用IRMS测定了来自意大利、法国和德国的葡萄酒的δ13C值，用于分析碳同位素比值在识别产地和鉴别产地真伪的作用。Jochen Jung等用GC-IRMS对葡萄酒中甘油的真伪进行了评估。Josep E. Giménez-Miralles等用IRMS结合NMR对发酵过程中生产的乙醇的δ13C进行测定，用于识别来自西班牙Valencia的红酒的产区。Ana I. Caba ero等用液相色谱结合同位素比质谱仪分析了葡萄酒中甘油和乙醇的稳定碳同位素。

3.2 欧盟和OIV检测标准
    　欧盟和国际葡萄酒及葡萄酒组织（OIV）在上世纪90年代中期就制订了用同位素比质谱技术对酒类进行检测的标准方法。标准颁布年份、方法名称、适用产品、所测组分、适用仪器和应用的同位素，见表2。

4 IRMS技术
在国内酒类研究的应用
    　在我国，同位素比质谱技术更多地用在地球科学、环境监测和气候变化研究等方面的工作。
　　现在，该技术也逐步应用于食品安全领域的研究，中国食品发酵工业研究院用GC-C-IRMS对食醋中乙酸的13C稳定同位素方法进行了研究。该院对酒类进行了初步研究，关注了饮料酒中乙醇氧同位素测定方法和生产过程中乙醇13C同位素机理，采用的是乙醇模拟饮料酒和白酒模拟发酵，并采集了工厂中高粱原料酿造的酒样和流通领域的商业高粱原料白酒样进行对比分析。结果发现6个商品酒乙醇δ13C超出95%置信区间，预测25%商品酒可能虚假标注，假冒固态法白酒。
4.1 我国葡萄酒
真实性技术标准立项
    　IRMS技术在白酒研究中应用刚刚起步，没有制定用IRMS技术检测白酒的相关标准，但用IRMS技术对葡萄酒制订技术标准已有立项研究（见表3所示），并取得了初步成果：《葡萄酒中水的18O/16O比值测定方法》和《起泡葡萄酒中二氧化碳的13C和12C比值测定方法》这两项行业标准已经征求了意见，不过还未发布。白酒在这方面应该向葡萄酒学习，便于用IRMS技术对白酒产品的检测。

4.2 IRMS技术
在白酒中应用展望
    　对白酒成品的研究，通常使用传统的仪器设备测定常规理化指标，比如用酒度计测定白酒的酒精度，滴定法测定总酸总酯，酒中氰化物的测定，用气相色谱测定白酒主要成分，这些指标只是宏观上的白酒质量和品质参数。
　　由于食品安全事故的频发以及对添加剂等食品领域监管力度的加强，一些白酒企业购置了较高端的仪器如液相色谱，用于检测白酒中安赛蜜和糖精钠含量。
　　但是，这些检测能力仅仅能满足产品标准的要求，用这些仪器和设备对白酒的质量进行控制、添加剂识别、白酒真伪进行鉴别是远远不够的。
    　同位素比质谱技术为更深入地对白酒进行研究提供了可能。在质量控制上，可采用该技术对采购的基酒进行把关，测定C或者O等其他元素的同位素比值，判断采购的基酒是否纯粮酿造，甚至可以判断酿造中各种粮食添加的比例。对于食用酒精在酿酒企业中的使用也可能给予质量控制，通过该技术或可以判断食用酒精所采用的原料。蒸馏酒及其配制酒新国标对氰化物的限量有了极大变化，这易导致木薯酒精勾兑的酒冒充纯粮酿造酒，如果采用同位素比质谱技术对白酒监管测试，则可能有效预防和杜绝木薯酒精勾兑酒的假冒问题。或者通过同位素比质谱技术也能对白酒中的添加物，如糖精钠、安赛蜜等其他添加剂进行测定。
    　在我国白酒产品区域集团化的进程中，同位素比质谱技术能够有很多用武之地。不同产品区域的气候条件不一样，致使酿造出的白酒产品可能在同位素比上有差异，这样就可通过IRMS技术识别各个白酒产区的产品。例如可通过IRMS技术确定“中国白酒金三角”区域酒的同位素比特征，通过这一技术强化区域品牌的独有性。
    　白酒产品的真实性鉴别和防伪对高端白酒市场来说是极为重要的。传统方式是用气相色谱建立质量指纹图谱库结合计算机专家识别系统来鉴别，此外更多的是通过感官品质来判别白酒的真实性。白酒防伪上，常注重包材的防伪技术，如采用防伪标签、激光防伪和防伪瓶盖等，但这些方法存在的缺点是不言而喻的，成本高、易被仿制。因此，可以利用稳定同位素比质谱技术测定酒体中相应成分的C、H或O元素的同位素比，建立白酒产品的同位素比数据库，为高端白酒的防伪提供支持。
    　白酒的年份鉴别，传统的方式是对酒进行感观品评，再结合常规的理化分析指标。白酒年份酒没有通认的标准，行业也没有鉴定不同贮存年份的白酒的标准，这在一定程度上刺激了“年份酒”市场的混乱。在鉴定方法上，剑南春研究人员发明了“挥发系数鉴别年份酒的方法”，能否适应不同的产品还有待商榷。然而，不能否认的事实是国外IRMS技术在葡萄酒年份鉴别上的研究成果表明IRMS技术应用于白酒不同贮存年份的鉴别是具有可能性的。从国内应用IRMS技术在白酒行业研究的现状来看，《白酒中乙醇稳定碳同位素13C和12C比值测定方法》标准已于2014年底开始征求意见，迈出了应用IRMS技术对白酒中不同元素同位素比值的研究，为后续利用IRMS开展白酒真实性鉴定奠定了初步基础，但还有更多工作需要开展。
5 总结
    　同位素比质谱技术是白酒掺假、溯源和真实性鉴定有用而可行的工具，结合不同的前处理工具可以得到白酒中不同成分如水、乙醇等高级醇中C、O、H等同位素比值信息，再利用相应的接口和软件实现白酒测定中不同同位素之间的全自动转换。这一技术必将对白酒质量控制和真实性鉴定起到重要的推动作用。