啤酒糟固态发酵产β—葡萄糖苷酶的研究

啤酒糟是啤酒工业中的主要副产物，是以大麦为原料，经发酵提取籽实中可溶性碳水化合物后的残渣。在国内，啤酒糟主要作为饲料被直接使用，利用效率很低。啤酒糟中含有丰富的蛋白质、脂肪、膳食纤维，氨基酸、糖类和多种微量元素，是良好的天然培养基，不仅可以发酵生产一些蛋白饲料，同时也可以用于工业酶制剂的生产。啤酒糟的再利用，可以增加啤酒工业的附加值，降低其生产成本。

   文章来源华夏酒报; 　β—葡萄糖苷酶又称β—D—葡萄糖苷葡萄糖水解酶，它可以水解糖链末端非还原性的β—D—葡萄糖苷键。β—葡萄糖苷酶是纤维素酶的主要组成成分，直接影响着纤维素酶的降解能力。

　　此外，β—葡萄糖苷酶在食品行业中也有着广泛的应用，如作为水果和茶叶的风味酶，水解大豆异黄酮甙元等。β—葡萄糖苷酶存在于自然界很多植物中，也存在于酵母、曲霉属、木霉属及一些细菌中。黑曲霉是公认安全的微生物之一, 在纤维物质的诱导下，黑曲霉可产生胞外β—葡萄糖苷酶。

　　笔者研究了黑曲霉固态发酵啤酒糟产β—葡萄糖苷酶的工艺条件，同时探讨了β—葡萄糖苷酶合成的动力学机制，望能为啤酒糟的再利用提供一定数据依据。

    　1 材料和方法
    　1.1 菌种
    　黑曲霉购于广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心。
    　1.2 试剂和设备
    　1.2.1 主要试剂
    　啤酒糟由蚌埠学院生物与食品工程系啤酒发酵实验室提供；
    　水杨苷（进口分装）、微晶纤维素（进口分装）、羧甲基纤维素钠（CMC）、 3， 5—二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、苯酚。
    　1.2.2 主要设备
    　752分光光度仪（上海菁华科技仪器有限公司）、DH Z—D冷冻恒温振荡器（江苏太仓市实验设备厂）、SFAT—8000固态发酵罐（常州新区三环生物工程成套设备有限公司）。

    　1.3 培养基
    　斜面培养基：PDA培养基；
    　发酵培养基：啤酒糟5g置于500ml 三角瓶中，用基本培养液调初始含水量，121℃灭菌20min。

    　1.4 试验方法
    　1.4.1 粗酶液的制备
    　黑曲霉在无菌条件下接入斜面培养基，30℃培养72h。每100ml  无菌水接入1环孢子配置种子悬浮液( 1.15×106 /ml )。按一定料液比将种子悬浮液接入灭菌后的发酵培养基中，培养96h。用100ml去离子水浸提培养基，搅拌1h，抽滤，在3000r/min条件下离心15min，收集上清液，即为粗酶液。
    　1.4.2 单因素分析
    　在其他条件不变的情况下，分别测定不同温度、料液比和接种量对β—葡萄糖苷酶酶活的影响。
    　1.4.3 正交分析
    　利用L9( 34 )正交试验优化β—葡萄糖苷酶的发酵条件。
    　1.4.4 动力学研究
    　发酵过程中，每隔24h分别测定发酵培养基中Cx 酶、β—葡萄糖苷酶和C1酶的活性，分析β—葡萄糖苷酶酶活随时间的变化情况。

    　1.5 酶活力的测定
    　1.5.1 β—葡萄糖苷酶活力的测定。取4支洗净烘干的10ml具塞刻度试管， 编号后各加入1.5ml0.5%水杨酸苷柠檬酸缓冲液，向1号试管中加入1.5mlDNS溶液以钝化酶活性，作为空白对照，比色时调零用。将4支试管同时在50℃水浴中预热5min—10min，再各加入酶液0.5ml，50℃水浴中保温30min，取出后立即分别向2、3 和4号试管中加入1.5ml DNS 溶液以终止酶反应，充分摇匀后沸水浴5min，取出冷却后用蒸馏水定容至10ml，充分混匀。
    　以1号试管溶液为空白对照调零点，测定2、3和4号试管液的吸光度值并记录结果。定义在测定条件下，1min内水解水杨酸苷生成1μmol葡萄糖所需的酶量为一个酶活单位（U）。

    　1.5.2 葡萄糖内切酶（CX）活力的测定 以羧甲基纤维素钠为底物，方法同上。
    　1.5.3 葡萄糖外切酶（C1）活力的测定 以微晶纤维素为底物，方法同上。
    　1.5.4 还原糖的测定 采用DNS（3，5—二硝基水杨酸）法。

    　2 结果与分析

    　2.1单因素分析
    　温度是黑曲霉生长的重要条件之一，它不仅影响着菌体的生长速率，同时也制约着代谢产物的水平。在30℃条件下，β—葡萄糖苷酶的活力最高，而40℃时酶活最低。值得注意的是，从培养基孢子生长情况上看，25℃条件下，黑曲霉产生的孢子稀疏，主要以菌丝体为主；而在37℃条件下，孢子生长的十分密集，但两者β—葡萄糖苷酶的酶活相差不是很大。

    　这一现象表明，两种产酶机制的不同，25℃更适合β—葡萄糖苷酶的生成，而37℃时，虽然产酶水平不高，但孢子数量巨大，产生的总酶活也高。
    　在固态发酵中，初始含水量主要影响着菌体对氧气的摄取。按料液比（培养基：水，g/ml）1：5配置培养基的初始含水量时酶活最高。当含水量过高时，由于限制了培养基对氧的摄取，产酶水平开始下降。

    　在一定范围内，随着接种量的增大，酶活逐渐变大，当接种量增大到10%以上后，酶活变化减小，这可能是由于菌种数量过大，导致培养基营养成分的迅速消耗，从而影响酶的产量（见表2）。

    　2.2正交试验优化发酵工艺
    　利用正交表设计L9（ 34 ）正交试验, 温度的三个水平分别为25℃、30℃和37℃；含水量分别为1：1、1：3 和1：5；接种量为2%、5%和10%（见表1）。

    　可以看出, 在25℃、含水量1：5和接种量10%的条件下, 酶活达到10.85U / g；其中含水量对β—葡萄糖苷酶酶活具有显著的线型相关（ p< 0.05）。

　　2.3 葡萄糖苷酶的合成特性
    　葡萄糖苷酶是纤维素酶的重要组成成分，在很大程度上决定着纤维素酶的活性。以啤酒糟为培养基，在30℃，接种量10%和料液比1：5的条件下，利用固态发酵罐进行发酵，每隔24h测定黑曲霉产β—葡萄糖苷酶， 绘制各种酶的酶活变化曲线。

    　Cx酶在72h时达到产酶的高峰期，而β—葡萄糖苷酶的酶活则继续增大。在96h后，β—葡萄糖苷酶酶活的增幅变小，这一现象可能说明，在96h时该酶已经进入产酶的高峰期；此后，由于菌丝体发生自溶，胞内的β—葡萄糖苷酶释放到培养基中，使酶活进一步变大。利用啤酒糟作为培养基，β— 葡萄糖苷酶的酶活要远高于Cx酶，而用其它培养基时，Cx酶的酶活要高于β—葡萄糖苷酶，这表明啤酒糟适合于β—葡萄糖苷酶的发酵生产。

    　3 结论

    　目前，β—葡萄糖苷酶主要是利用微生物发酵进行生产，尤其是黑曲霉和米曲霉，培养基多为麸皮、蛋白胨和各种无机盐。

　　有研究表明，初始pH值对于β—葡萄糖苷酶的产量有着重要的影响。

    　啤酒糟富含各种营养成分，有利于诱导β—葡萄糖苷酶的产生，可能成为该酶发酵生产的天然培养基。实验表明，在25℃，料液比1：5和接种量10%的固态发酵条件下，酶活可达到10.85U / g；动力学研究显示，β—葡萄糖苷酶在96h进入产酶高峰期，120h时达到酶活最高值。此外，发酵后的啤酒糟由于纤维结构被破坏，从而更容易被动物吸收，可能成为较好的有机饲料。