关于非酿酒酵母在葡萄酒中的研究

目前，葡萄酿酒酵母菌的研究不再局限于酿酒酵母菌，非酿酒酵母的酿酒特性研究等研究成为国内外近年来的研究热点。非酿酒酵母是一类自然存在于葡萄酒发酵中的微生物，其代谢物对葡萄酒的香气和风味等感官特点有着重要的影响。该文综述了非酿酒酵母在葡萄酒生产中的研究进展，以期对我国葡萄酒酿造提供参考。
关键词：非酿酒酵母菌；香气；酿造；混菌发酵
1前言
    　葡萄酒的酿造本质上是一个微生物作用的过程，这些微生物中最主要的是酵母菌。
　　由于来自于葡萄及酿酒环境中的酵母菌具有多样性，因此葡萄汁发酵是由酵母菌群体相互作用引起的。
　　葡萄酒生产中除了酿酒酵母（Saccharomyces）外，主要的非酿酒酵母（non-Saccharomyces）有克勒克酵母（Kloeckera）、梅氏酵母（Metschnikowia）、汉生酵母（hansenula）、有孢汉生酵母（Hanseniaspora）、假丝酵母（Candida）、接合酵母（Zygosaccharomyces）和酒香酵母（Brettanomyces）等。
　　在发酵过程中，非酿酒酵母与酿酒酵母一起消耗营养物质并产生二级代谢物，同时其具有一定的果胶酶、葡萄糖苷酶、脂肪水解酶、蛋白质水解酶和尿酶活性，从而影响葡萄酒的发酵风味。
　　非酿酒酵母普遍的特点是不耐高浓度的酒精、对SO2 较敏感，并且会产生高浓度的乙酸和乙酸乙酯。
　　早先，非酿酒酵母并不被看好用于葡萄酒的生产，但是最近几十年来，国内外通过对优良酵母的筛选和特性研究，以及通过改良技术对优良酵母菌的改良，筛选培育出了能够满足消费者口味的特色菌株。
　　这些菌株逐渐被应用于葡萄酒的生产，以提高酒的特色风味和总体风味，使酒的风味特征得到了明显改善。目前，非酿酒酵母已经引起了研究人员的极大关注。
   
2非酿酒酵母的研究进展概况
    　对于葡萄酿酒酵母资源的相关研究，早期主要是以酿酒酵母为主。
　　近年来, 研究者们除了侧重于酿酒酵母菌系的多样性、葡萄酿酒酵母菌与葡萄酒风味的关系、不同菌株对葡萄酒香气的影响及合成与代谢的研究之外，也注意到了除了酿酒酵母以外的其他属、种的酵母菌对于地区特色品种的葡萄的特色风味的影响。
　　非酿酒酵母由于参与葡萄酒发酵的代谢过程，每个不同的种都以特异性的代谢活动为特征，对于葡萄酒的质量和风味，特别是香气质量具有非常重要的影响。
    　国外学者对产香和产酒酵母在葡萄酒生产上的研究和应用都比国内要早许多，并且率先研究产香和产酒酵母的连续混合培养发酵。
　　西班牙的J.M.emente-Jimenez等为改进酒中芳香化合物和酒质，分离出耐酒力的毕赤氏酵母S. cerevisiae 和产芳香物质多的酵母Pichia fermentans，通过连续混合培养发酵生产干白葡萄酒，其研究结果表明：Pichia fermentans在制酒工业上是一种很好的起始菌株，通过连续混合发酵，仅仅在两天之内，就能够得到足够（质量和数量上）的必需芳香物质。这是对产香酵母和产酒酵母进行连续混合发酵成功的一次报道。
3非酿酒酵母在葡萄酒中的存在情况
    　尽管至今为止世界各地所发现的与葡萄酒相关的酵母种类是相似的，但是受到气候因素的影响，在不同的地区，各种酵母菌的比例和数量有着明显的不同。
　　如在降雨量大的地区，葡萄成熟时非酿酒酵母的数量会增加。
　　研究人员普遍认为，葡萄园中最多的是柠檬克勒克酵母（K. apiculata）和葡萄汁有孢汉生酵母（Hanseniaspora uvarum），占分离菌株的50%~75%。
　　而在炎热地区的葡萄园中，葡萄汁有孢汉生酵母（Hanseniaspora uvarum）为主要菌种。
　　如果在寒冷地区的葡萄园中，柠檬克勒克酵母（K. apiculata）则会占大多数。
　　在中等气候地区，柠檬克勒克酵母（K. apiculata）和葡萄汁有孢汉生酵母（Hanseniaspora uvarum）这两种非酿酒酵母的数量则大致相当。
　　在经常使用杀虫剂和其他化学剂的产区，酵母菌的数量也会有所变化。
　　在没有使用化肥的葡萄园中，酿酒酵母菌的数量较多，而某些杀虫剂能刺激柠檬克勒克酵母（K. apiculata）生成更多的酒精，在一定程度上也增加了其他代谢物的产生。
　　由上述内见可见，地理位置、气候和土壤环境对酵母是有影响的。
    　葡萄酒相关酵母广泛地存在于葡萄园、葡萄表皮、酒厂的生产设备等环境中，通过压榨过程进入葡萄浆中。
　　在自然发酵早期，经常会发现克勒克酵母、有孢汉生酵母、红酵母、毕赤酵母、假丝酵母（星形假丝C.stellata、铁红假丝C.pulcherrima、清酒假丝C.sake）和隐球酵母等，但含量相对较少，为103cfu/mL~106cfu/mL，其中柠檬克勒克酵母最多，其次是假丝酵母。
　　当达到发酵中期，酒精度为5%vol~8%vol时，有的酵母数量开始下降，生长受到抑制。有一些非酿酒酵母可以一直存活到发酵第12天，而有的可以贯穿整个发酵期，细胞数为106cfu/mL~108cfu/mL，星形假丝酵母、星形球拟酵母可耐受12%vol的酒精。
　　而发酵结束的酒中，只有一小部分非酿酒酵母存在，如酒香酵母、德克酵母（Dekkera）、拜耳结合酵母（Z.bailii）、膜醭毕赤酵母（P. membranifaciens）、克柔假丝酵母（C. krusei）和粗状假丝酵母（C. valida）。其中，酒香酵母和接合酵母是和酿酒酵母一样耐受酒精的，通过过滤方可去除。但是大部分非酿酒酵母在葡萄浆发酵旺盛的时候消失了，因为其生长相对缓慢，又受到了葡萄浆的渗透压、低pH值、氧气缺乏和乙醇含量升高的影响，同时营养的限制和酿酒酵母的接种量也抑制了非酿酒酵母的存活。
　　掌握非酿酒酵母特性，适当调整和改变酿造工艺条件，可以大幅度提高非酿酒酵母的存活率，进而改变葡萄酒的最终质量。
4非酿酒酵母菌在葡萄酒中的作用
&nbs文章来源华夏酒报p;   　葡萄汁的发酵前期存在大量非酿酒酵母属的酵母，其中柠檬形酵母（ Hansenula uvarum & Kloeckera apiculata）是主要菌种，细胞浓度可达106~107 个细胞/mL。
　　而在发酵末期，酒香酵母（Brettanomyces ）、克鲁维酵母（ Kluyveromyces）、裂殖酵母（ Schizosaccharomyces ）、有孢圆酵母（ Torulaspora）、接合酵母（ Zygosaccharomyces ）及酿酒酵母（ Saccharomycodes）等属的酵母也可检测到。这些菌的活动对葡萄酒的化学成分和最终感观具有重要影响。
    　早期的研究认为，非酿酒酵母属酵母，耐酒精能力弱，发酵力低，仅能产生3% ~ 5% ( VPV) 的乙醇，存活时间短，同时产生大量的醋酸，因此，一直被列入葡萄酒酿造的有害菌种之中。
　　但是，近期的大量研究发现，非酿酒酵母在葡萄酒发酵过程中具有比原来认为的更加有意义的作用。
　　非酿酒酵母与酿酒酵母相比，可以产生和分泌多种胞外酶。胶质酶可增加葡萄汁的提取，促进酒的澄清。
　　B-糖苷酶是水解的非挥发性的糖苷香气物质前体，蛋白酶能增加澄清，酯酶是重要的发酵香气成分，脂肪酶能分解葡萄或酵母自溶的脂肪。这些酶与葡萄汁相互作用，展现并产生不同的品种和发酵香气。
　　B-糖苷酶在葡萄酒酿造中具有重要的作用，它能够水解葡萄酒中以糖苷键结合的非挥发性风味前提物，释放出风味活性物质。与浆果本身的葡萄糖苷酶相比，酵母的糖苷酶不受葡萄糖的抑制。
    　人们发现一些种属如假丝酵母、克勒克酵母或有孢汉逊酵母可以通过代谢和自溶来提高葡萄酒的香气，参与复杂新鲜的风味物质的形成。
　　野生酵母能生成酯类、高级醇、甘油、醛和琥珀酸等影响葡萄酒感官特点的重要成分。目前, 星形假丝酵母（Candida stellata）和戴尔有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii ）已是公认的对葡萄酒感官特征具有积极影响的菌种。
　　1998年, Ciani 等人在对五种非酿酒酵母的酿酒特性的研究中指出C.stellata具有持续高产甘油的特性，其平均甘油产量可达11176gPL。
　　同时，T.delbrueckii也是经常存在于酒厂环境中的酵母，早在1954 年,Castelli就指明该菌具有极高的发酵纯度，因此曾作为发酵的启动菌。
　　此外,该菌的其它酒精发酵特性也对葡萄酒的感官具有积极的作用。
　　柠檬型的kloeckera apiculata（ H .uvarum） 由于产生过多的醋酸和乙酸乙酯，以及低的酒精产量，一般认为是对葡萄酒质量不利的菌种。
　　然而,Roman（2003）发现有很大数量的H .uvarum 酵母的产醋酸能力低于1gPL，可以用于与酿酒酵母混合发酵。
　　Ciani（1998）也曾在自然葡萄汁中发现低产醋酸的K . apiculata的菌株。
　　此外， K .apiculata菌的醋酸和乙酸乙酯的产量均与其乙醇产量反相关。因此对于葡萄酒感官结构具有很好的平衡作用。
5混菌发酵
    　当前葡萄酒生产多选用酿酒酵母，优点是发酵快、成品酒稳定性高、质量一致。
　　而非酿酒酵母在葡萄酒生产中完全发酵的能力不够，产酒精的能力也稍差。
　　但是非酿酒酵母具有很多对葡萄酒感官有利的影响，同时也存在一些消极作用。
　　因此，如果能够充分的利用两大类酵母的特点和优势，尤其是发酵早期的非酿酒酵母和酿酒酵母的相互作用，进行混和或顺序接种发酵，会使葡萄酒具有更加复杂的口感和香气，也可以改善单一菌种所带来的不良影响。
　　采用混合发酵，使不同的菌种取长补短，也是当前的一个研究热点。
　　Nathalie moreria 等（ 2005 ）对H . uvarum，H .guilliermondii 和S. cerevisiae 的纯种发酵及混合发酵进行了研究。
　　他们发现，其中H .guilliermondii具有最高的生长力，同时也是最佳的2-乙酸苯乙酯和2-苯基乙醇的产生者，并且不受其他菌的影响。
　　用酿酒酵母和H . guilliermondii混合发酵最显著的特征是2-苯乙醇和2-乙酸苯乙酯的明显增加，其中2-苯乙醇可达613mgPL， 而在单纯的酿酒酵母发酵中产生的2-苯乙醇不超过1112mgPL。2-乙酸苯乙酯只存在于H .guilliermondii的发酵基质中，可达1111mgPL,而一般的酿酒酵母仅可产生0122~0125mgPL。这些物质可赋于葡萄酒果香与花香。
6展望
    　随着分子生物学技术的发展，利用基因工程改造非酿酒酵母获得具有新的理想特征的各种酵母菌种，酿造具有复杂口感、风格独特的葡萄酒将会成为现代葡萄酒产业发展的重要方向。
　　国内的葡萄酒生产中广泛使用活性干酵母进行发酵，这不仅使产品的同质化加剧，也会抑制自然界中的酿酒酵母及其它野生酵母的进化发展，同时又浪费了大自然给予我们的宝贵财富。
　　因此, 加强葡萄酒相关酵母的研究及非酿酒酵母的利用对我国葡萄酒的良性发展具有十分重要的意义。