利用微生物生产多粮浓香型白酒粮香、糟香、窖香风味物质

　以五粮液为代表的宜宾多粮浓香型白酒的生产离不开当地独特的自然环境，作为中国酒都，地处三江交汇处，宜宾特殊的气候环境孕育出了独特的酿酒微生物生态区系。
　　一般认为，在浓香型白酒生产过程中，霉菌主要起糖化作用，酵母发酵产生酒精，细菌主要参与形成白酒复杂的风味和香气。
　　四川省申联生物科技有限责任公司的科技人员利用纯培养的方法对多粮浓香型白酒生产环节中优势细菌开展研究，并筛选出5株对宜宾多粮浓香型白酒酒体独特风格起主要作用的微生物菌株。
　　四川省申联生物科技有限责任公司运用现代发酵技术及超临界萃取技术，生产出多粮浓香型白酒风味物质。

1材料与方法
    　1.1材料
    　1.1.1菌种
    　从四川某浓香型酒厂酿酒车间的窖泥、酒糟、、黄水中筛选。分别编号SL0015、SL0061、SL0098、SL0106、SL0158，4℃保藏备用。
    　1.1.2试剂
    　高纯二氧化碳，食品级99.99%。
    　1.1.3主要仪器和设备
    　Agilent CC 6890-5975 rnfKs，美国安捷伦科技有限公司；Agilent C-C 6890-FID，美国安捷伦科技有限公司；DD-6低速大容量离心机，济南福的机械有限公司；超临界萃取设备，HA120-50-01A，江苏南通华安超临界萃取有限公司；UF-20型实验型超滤装置，华泰净化技术工程有限公司；10L发酵罐，50L发酵罐，江苏镇江东方生物工程设备技术有限责任公司。
    　1.1.4培养基
    　1.1.4.1种子液培养基
    　牛肉膏蛋白胨培养基、葡萄糖胰胨培养基。
    　1.1.4.2发酵培养基（g/L）
　　葡萄糖　20；小麦粉　10；酵母膏　1；（NH4）2SO4　0.5；MgSO4·7H2O　　0.2；FeSO4·7H2O　0.1；K2HPO4·3H2O　0.2 ；高粱粉　10；乙醇　20。
    　1.2方法
    　1.2.1种子液培养
    　将菌种接种于种子培养液中，其中SL0015、SL0098、SL0106培养温度42℃，150rpm，培养28小时。SL0061、SL0158培养温度35℃，静止培养，培养3天。
    　1.2.2发酵培养
    　1.2.2.1各菌种单独培养。
    　1.2.2.2各菌种混合培养。
    　1.2.3感官评定
    　品评人员由国家评酒委员和从事白酒研究工作并经过半年闻香训练的人员组成。每个样品由四名品评人员分三次进行品评。在20℃的品评环境下，评价发酵液的浓香，按很弱、弱、一般、强、很强五个等级分类。
    　1.2.4发酵液中特征性风味化合物的分析
    　1.2.4.1GC-MS分析
    　样品通过DB-Wax毛细管柱进行分离，程序升温条件：初温40℃，恒温5min，然后以8℃/min的速率升至230℃，保持30min。
　　进样量：1μL，不分流。载气：He；流速：2 mL/min。分离后的样品用Agilent 5975MSD鉴定。质谱条件El：电离源；电子能量：70 eV；离子源温度：230℃；扫描范围：30amu～550amu。
    　1.2.4.2 物质定性分析
    　将未知物质谱图与NIST 08a.L Database（Agilent Technologies Inc．）中标准谱图进行比对定性。
    　1.2.5超临界CO2萃取
    　1.2.5.1预处理
    　发酵液→粗过滤→超滤→清液
    　1.2.5.2　
    　取1L发酵清液投入萃取釜，将萃取釜温度升至设定值后开启CO2泵，萃取压力升至设定值后进行流动萃取，从解析釜出料口得萃取物，将所得液体进行GC—MS分析。
2结果与讨论
    　2.1单独培养与混合培养比较
    　发酵结束后，取样进行感官评价，结果见表1。
    　从表1可以看出，筛选出的菌株进行单独培养，所产香气均不强，而混合培养，则香气浓。
　　这与菌种间的协同作用有关，因为某种菌种的产物可能是另一种菌种的前体物质，或是两种菌种的产物在酶的作用下进行一些反应，如酯化反应等。
    　2.2混合培养条件的研究
    　2.2.1培养基的选择
　　培养基A（g/L）
　　牛肉膏　10；蛋白胨　5；酵母膏　5；葡萄糖 40；（NH4）2SO4 0.5 ；MgSO4·7H2O　0.2；FeSO4·7H2O　0.1；K2HPO4·3H2O　0.2；CaCl2　0.1。
    　培养基B（g/L）
　　葡萄糖　20；小麦粉　10；酵母膏　1；（NH4）2SO4　0.5；MgSO4·7H2O 0.2；FeSO4·7H2O　0.1；　K2HPO4·3H2O　0.2；高粱粉　10；乙醇　20。
    　培养基C（g/L）
　　小麦粉　10；高粱粉　10；玉米粉　8；大米粉　5；糯米粉　5。
　　利用上述培养基分别发酵，发酵结束后，取样进行感官评价，结果见表2。
    　从表2可知，培养基A营养丰富，菌种生长快，但产香弱；培养基C产香强，但生长太慢；而培养基B取了A、C的优点，菌种生长较快，产香强。我们选培养基B作为以下试验的培养基。
    　2.2.2培养温度的选择
    　我们以下列控温方式做试验：①35℃②先35℃后42℃③42℃，发酵结束后，取样进行感官评价，结果见表3。
    　从表3可以看出，控温方式以先35℃、后42℃为最佳。
    　2.2.3培养PH的选择
    　我们分别维持PH5、6、7、8进行发酵，发酵结束后，取样进行感官评价，结果见表4。
    　从表4可以看出，PH在6时产香最强。
    　2.2.4　接种量的选择
    　我们设计的试验见表5。
    　发酵结束后，取样进行感官评价，结果见表6。
    　从表6可以看出，菌种SL0015、0061、0098、0106、0158按5%、10%、5%、5%、10%的接种量接种进行混合培养，产香最强。
    　2.3超临界CO2萃取条件的研究
    　2.3.1萃取温度的确定
    　超临界CO2 的临界点为7.52 MPa、31.1 ℃, 因此试验的温度、压力都不能低于这个数值。另外，由于超临界CO2 所萃取的物质一般都为热敏性物质，萃取温度不能太高，所以对萃取温度的调节非常重要。通过四组单因素试验确定萃取温度，试验结果见表7。
    　通过以上试验可以看出，3号样虽然萃取率略低于2号样，但其风味更佳，所以萃取温度选为45℃。
    　2.3.2萃取压力的确定
    　选取萃取压力的试验结果见表8。
    　从表8可以看出，13号样品萃取率高且风味好，因此萃取压力确定为15MPa。
    　2.3.3 CO2流量的确定
    　选取CO2流量的试验结果见表9。
    　从表9可以看出，不同的CO2流量对所得萃取物的品质无影响，但在相同的萃取时间下，流速越大，萃取得率越高。因此确认CO2 流量为10L/h。
    　2.3.4分离温度的确定
    　选取分离温度的试验结果见表10。
　　从表10可以看出，分离温度越低，萃取率越高，但品质不好，所以分离温度选取为50℃。
    　2.3.5分离压力的确定
    　选取分离压力的试验结果见表11。
    　从表11可以看出，分离压力越大，萃取率越低，但品质更好，综合考虑确定分离压力为7MPa。
    　2.3.6 解析釜压力、温度的确定
    　为确保在解析釜中萃取物质的完全解析，解析压力越低越好，但考虑到CO2能重复利用，因此，解析压力与CO2 储罐中压力相同，即在4.5～6.0MPa之间，解析釜温度设定为55℃。
    　2.3.7 萃取时间的确定
    　萃取时间在4h 文章来源华夏酒报后，产品得率很小，亚油酸、7-烯十六酸，萃取时间为4h。
　　2.4萃取物的分析
　　以萃取压力15 MPa,萃取温度45℃，CO2 流量为10L/h，柱分离压力为7MPa, 分离温度为50℃，解析釜分离压力为4.5～6.0MPa, 温度为55℃，萃取时间为4h作为控制条件进行超临界CO2萃取, 萃取得率为5.48%。把萃取物进行GC-MS分析，得到萃取物的质谱图。
　　萃取物中主要成分如下：
    　醇类：乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、仲丁醇、正戊醇、2-戊醇、异戊醇、β-苯乙醇、正己醇、2-庚醇、3-甲基苯甲醇、9,12,15-三烯十八醇。
    　多元醇：1，2-丙二醇、2，3-丁二醇、1，,3-丁二醇、丙三醇。
    　酸类：乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸、己酸、庚酸、辛酸、癸酸、苯乙酸、十五酸、十六酸、十七酸、十八酸、油酸、亚油酸、7-烯十六酸。
    　酯类：乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、十三酸乙酯、苯乙酸乙酯、甲酸-2-丁酯、乙酸异戊酯、十五酸乙酯、十六酸乙酯、棕榈酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯、十七酸乙酯、亚麻酸乙酯、油酸癸酯、油酸单甘油酯、乳酸乙酯、苯甲酸乙酯、月桂酸乙酯、苯丙酸乙酯、丁二酸单乙酯、甲氧基乙酸乙酯、11-十六烯酸乙酯、2-氯油酸乙酯、琥珀酸双乙酯、邻苯二甲酸二丁酯。
    　酚：对丁酸甲酯酚、对乙醇酚、对乙基酚、4-乙烯基愈创木酚。
    　胺：乙酰胺、3-甲基丁酰胺。
    　烷：辛烷、1，1-二氧基戊烷、1，1-二乙氧基异戊烷、2-乙氧基苯烷、2，3-二苯基丁烷。
    　酮：丙酮、5-甲基-2-己酮、6，10，14-三甲基-2-十四酮。
    　醛：乙醛、异丁醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、苯甲醛、2，4-二烯癸醛。
    　杂环类：苯乙酰吡唑、2-苯基-4，5-二甲基-1，3-二氧五环、2-苯基-1，3-二氧六环、2-苯基-4-甲基-1，3-二氧五环、糠醇、2-甲酰吡咯、2-羟基-3，4，5-三氢呋喃、2-羟基吡咯、氮甲基-2，4-二烯-2-甲酰吡咯、三甲基吡嗪、2，5-二甲基吡嗪、2，3-二甲基吡嗪、2，6-二乙基吡嗪、四甲基吡嗪、吡啶、3-羟基吡啶、糠醛、2-戊基呋喃。
3结论
    　3.1确定多菌种混合发酵的培养模式
　　以筛选的微生物菌株进行多粮浓香型白酒的呈香呈味物质的生产，并确定了多菌种混合发酵的培养模式
    　3.2确定超临界CO2萃取最佳工艺
　　萃取压力15MPa，萃取温度45℃，CO2 流量为10L/h，柱分离压力为7MPa, 分离温度为50℃，解析釜分离压力为4.5～6.0 MPa，温度为55℃，萃取时间为4h。